Группа клеточной биологии

Заведующая – Е.С. Надеждина
 
Группа клеточной биологии внесла значительный вклад в изучение структуры, функции и регуляции активности белка кинезина-1. Кинезин-1 – это стимулируемая микротрубочками АТФаза, которая способна перемещаться от минус- к плюс-концу микротрубочек, т.е. от центра клетки к ее периферии, или по антероградному пути. При этом кинезин-1 может переносить связанные с ним карго – субклеточные частицы и органеллы. В работах сотрудников группы клеточной биологии было показано (слайд CBG1a, 1), что, в частности, кинезин-1 переносит пигментные гранулы в меланофорах, а также способствует равномерному распределению по фибробластам виментиновых промежуточных филаментов, «растаскивая» их из околоядерного скопления к краям клеток.

Молекула кинезина-1 состоит из двух тяжелых цепей, несущих АТФазный домен, и двух легких, участвующими во взаимодействии кинезина с его карго. В работах сотрудников группы клеточной биологии были клонированы кДНК легких цепей кинезина-1 из клеток CHO (фибробласты яичника китайского хомячка), и оказалось, что легкие цепи имеют вариабельную С-концевую часть. (слайд CBG1a, 2). Всего было идентифицировано 5 вариантов (изоформ) легких цепей кинезина-1. Было показано, что в молекуле кинезина-1 содержатся всегда две идентичных легких цепи, или же иногда легких цепей нет. Кинезин-1, содержащий изоформу легких цепей KLC-B специфично связывается с митохондриями, а изоформу KLC-D – с цистернами аппарата Гольджи, т.е. изоформы легких цепей обуславливают специфичность взаимодействия кинезина-1 с его карго.

Митохондрии активно перемещаются по клетке, и их движение зависит от кинезина-1. Однако при некоторых воздействиях на клетку митохондрии становятся неподвижными. В работах сотрудников группы клеточной биологии показано, что переход митохондлрий к неподвижному состоянию связан с формированием пучков актиновых филаментов. В связывании митохондрий с актиновыми филаментами участвуют также и виментиновые промежуточные филаменты – в отсутствие этих филаментов подвижность митохондрий теряет способность к регуляции (слайд CBG2a).

Микротрубочки клеток, полимеры белка тубулина, очень динамичны. Они постоянно растут, разбираются, растут вновь, и в клетках их система сохраняет радиальное строение с центром в центросоме. Различают динамическую нестабильность микротрубочек, когда их рост и разборка, чередуясь, происходят на плюс-конце, у края клетки, и тредмиллинг микротрубочек, когда рост происходит на плюс-конце, а разборка – на минус-конце. В работе группы клеточной биологии показано, что в присутствии в клетках центросомы превалирует динамическая нестабильность микротрубочек, но в отсутствие центросомы динамика микротрубочек переключается на тредмиллинг (слайд CBG3a, 1). Это сопровождается снижением количества полимеризованного тубулина. Таким образом, показана роль центросомы в стабилизации минус-концов микротрубочек, что переключает динамику клеточных микротрубочек на динамическую нестабильность.

В работах группы клеточной биологии была клонирована новая серин-треониновая протеинкиназа млекопитающих LOSK (Long Ste20-like Kinase). Эта киназа принадлежит к семейству Ste20-подобных протеинкиназ. Функции Ste20-подобных протеинкиназ в клетках остаются непонятными, предполагают их участие в МАР-киназных каскадах в качестве киназ киназ киназ митоген-активируемых киназ (МАРКККK). В работах группы показано, что LOSK частично ассоциирован с микротрубочками и центросомой. Это конститутивно активная киназа гистонового типа, не имеющая в своей молекуле известных регуляторных доменов. При подавлении активности LOSK при синтезе в клетках доминантно-негативного мутанта, происходит подавление способности центросомы связывать и стабилизировать минус-концы микротрубочек, хотя способность центросомы нуклеировать микротрубочки сохраняется (слайд CBG3a, 2). Аналогично действует и подавление синтеза LOSK в клетках методом РНК-интерференции.

Наконец, в работах группы клеточной биологии показано, что формирование в клетках стрессовых гранул – РНП-комплексов, возникающих в ответ на стресс, в частности, при обработке клеток арсенатом, зависит от микротрубочек. При разрушении микротрубочек стрессовые гранулы не образуются, а разрушение актиновых филаментов на них не влияет (слайд CBG4a). Показано также, что от микротрубочек зависит и разборка гранул при действии циклогексимида. Стрессовые гранулы способны перемещаться по клетке, и их движение подавляется при разрушении микротрубочек. Компоненты стрессовых гранул обмениваются с цитоплазмой, и этот обмен также значительно замедляется после разборки микротрубочек. Таким образом, микротрубочки необходимы для пространственного перемещения компонентов стрессовых гранул (полиА-связывающего белка, фактора eIF3, белка TIA-1).

Группа надмолекулярных белковых структур

Заведующий – О.В. Фёдоров
 
Flagellins of the normal and mutant stains of Salmonella and E.coli have been studied by scanning microcalorimetry, circular dichroism, limited proteolysis and immunology methods. It has been shown that the central part of the polypeptide chain of bacterial flagellins has a variable length, depending on the bacterial species, and determines the surface properties of the bacterial flagellum, namely its antigenic specificity. About 160 N-terminal and 100 C-terminal amino acid residues are responsible for the polymerization properties of flagellin. An essential part of these residues (about 70 N- and 50 C-terminal ones) acquires a regular structure only upon building into the polymer. We have called this stage as the protein co-assembling folding. This phenomenon permitted us to explain some previously incomprehensible facts especially the way of constructing of a helical supramolecular structure from identical subunits.

The principle of formation of a supramolecular helical structure of archaeal flagella from Halobacterium salinarum is different from that of bacterial ones. H. salinarum flagella are composed of several distinct flagellin proteins (A1, A2, B1, B2, B3). The roles of these flagellins were assessed by studying mutants of H. salinarum with an inactivated either A or B operon. We have shown that A1 and A2 flagellins are required for the formation of long helical filaments Mutants possessing only one of A flagellins have straight flagella. Each A flagellin forms its own protofilament. Association of two protofilaments produces a helical filament.

Группа термодинамики белка

Заведующий – С.А. Потехин
 
1. One of the greatest results of the group was the development of novel highly sensitive instruments for studying solutions of biological macromolecules. Among which are scanning microcalorimetrs DASM-1M, DASM-4, SCAL-1, vibratory densimeter AD-1, rotary viscosimeter AV-1 and a model in operation of titration microcalorimetr. At the moment we are constructing a set of instruments for studing of energetic of macromolecules stabilization under increased pressure (up to 5000 atmosphere).

2. With the objects of analyses being more complex it became necessary to design and computer aid algorithms for analysis of calorimetric data, in particular those obtained for multidomain proteins and nucleic acids. We have developed a number of software programs that are widely used for data accumulation and analysis of calorimetric data.
The above allowed us to perform various studies of thermodynamics of unfolding of small globular proteins, DNAs, multidomain and fibrous proteins, RNAs and lipids, i.e. practically all classes of biological macromolecules. Therefore the results of our studies were published not only in original papers but also were the basis of numerous reviews.

3. Comparative analysis of the known α-helical coiled coil structures allowed us to design a 34-residue peptide which form a very stable five-stranded coiled coil fibril with molecular weight about 1000 kDa. The fibrillogenesis is completely reversible. To our knowledge, this is the first α-helical peptide with such fibril-forming potential. These fibrils can be widely used in medical treatments and biotechnological processes as a linear multivalent complex where a higher efficiency can be achieved by associating a larger number of functional subunits.